操作指南(以下是 SparkJade 的推荐方案。本方案仅提供指导原则,请根据您的具体实验进行修改)
1. JC-1 染色液的配制
1.1 制备储存液
用 DMSO 配制 5 mg/mL 的 JC-1。如用 1 mL DMSO 溶解 5 mg JC-1。
【注】:JC-1 储存液建议分装后于 -20℃ 或 -80℃ 避光保存。
1.2 工作液的配制
用预热好的无血清细胞培养基或 PBS 稀释储存液,配制成 1-20 μg/mL 的 JC-1 工作液。
【注】:1)请根据实际情况调整 JC-1 工作液浓度,且现用现配。
2) 如果 JC-1 进入细胞的效果不好,可向工作也液中加入适量 20% Pluronic F127 溶液,终浓度为 0.02-0.05%,Pluronic F127 可以防止 JC-1 在缓冲液中聚合并帮助其进入细胞。
2. JC-1染色
2.1 以6孔板为例进行细胞铺板,密度为 5×105 cells/mL。37℃,5% CO2 培养箱培养过夜。
【注】:进行凋亡诱导时的细胞密度建议不超过 1×106/mL,也可根据自己的细胞类型培养至合适的密度。
2.2 取 0.5 mL 细胞悬液至无菌的离心管内。
2.3 400 g 离心 3-5 分钟;弃上清。
2.4 用 1 mL JC-1 工作液重悬细胞,于 37℃,5% CO2 培养箱孵育 15-30 分钟。
2.5 室温条件 400 g 离心 5 分钟;吸掉上清。
2.6 用 2 mL 细胞培养液或者缓冲液重悬细胞,之后室温条件 400 g 离心 5 分钟;弃上清,重复两次。
2.7 用 1 mL 新鲜培养液或者缓冲液重悬细胞,立刻进行后续的流式分析或荧光显微镜观察。
2.8 数据分析 (流式细胞仪):含有红色 JC-1 聚集物的健康细胞线粒体用 FL2 通道检测;含有绿色 JC-1 单体的凋亡或不健康细胞用 FL1 (FITC) 通道检测。
【注】:若用于酶标仪检测,用 300 μL 缓冲液重悬细胞;然后按照每孔 100 μL 的量将染色好的细胞转移到不透光的 96 孔板内,即可进行荧光酶标板分析。