Sulfo-Cy5.5 是一种用于标记生物分子的近红外荧光 CY 染料，如肽、蛋白质和寡核苷酸。CY 为花菁 (Cyanine) 的缩写，是由奇数个甲基单位连接的两个氮原子组成的化合物。菁类化合物具有波长长、吸收和发射可调、消光系数高、水溶性好、合成相对简单等特点。CY 系类染料常被用于蛋白，抗体以及小分子化合物的标记，对于蛋白抗体的标记，可以通过简单的混合反应来完成结合。

肿瘤；代谢；免疫/炎症；神经科学；心血管

Cy5.5 含有一个游离胺基，可以与各种官能团共轭，包括 NHS 酯和环氧化物。Cy5.5 激发最大值为 680 nm，发射最大值为 710 nm。Cy5.5 已被应用于各种基于荧光的实验。Cy5.5 是一种远红 (和近红外) 发射的染料，非常适合于担心背景荧光的荧光测量。Cy5.5 具有成本效益，其标记化学反应容易进行，因此适合于潜在的抗癌药物开发 ^[1]。

Cy5.5 标记的 VIIa 因子用于肿瘤的成像。用这些靶向蛋白标记的 Cy5.5 能特异性地定位到肿瘤异种移植体上至少 14 天，但未结合的 Cy5.5 不能定位到任何异种移植体或器官上。这种在肿瘤 VECs 中对抗组织因子进行成像的方法可能有助于检测原发肿瘤和转移，以及监测体内治疗反应 ^[1]。

与 Cy5.5 标记的乳铁蛋白共轭的 pH/温度敏感的磁性纳米凝胶 (Cy5.5-Lf-MPNA 纳米凝胶) 被开发为一种有前途的造影剂，用于胶质瘤的术前 MRI 和术中荧光成像 ^[2]。

操作指南 (以下是 SparkJade 的推荐方案。本方案仅提供指导原则，请根据您的具体实验进行修改)

1. 原液制备
1. 蛋白准备
为了获得最佳标记效果，请将蛋白 (抗体) 浓度配制为 2 mg/mL。
1) 蛋白溶液 pH 值应为 8.5±0.5，若 pH 低于 8.0，则用 1 M 碳酸氢钠进行调整。
2) 若蛋白浓度低于 2 mg/mL，标记效率会大大降低，为了获得最佳标记效率，建议最终蛋白质浓度范围为 2-10 mg/mL。
3) 蛋白必须在不含伯胺 (如 Tris 或甘氨酸) 和铵离子的缓冲液中，否则会影响标记效率。
2. 染料准备
将无水 DMSO 稀释 CY 染料，制成 10 mM 储备溶液。通过玻璃管或旋涡充分混合。
注：CY 储存液建议分装后于 -20 ℃ 或 -80 ℃ 避光保存。
使用前需先使用缩合液 (500 μg/mL) (SJ-MX6050) 活化后方可进行后续标记实验。
3. 染料工作液用量计算
标记反应所需的 CY 染料用量取决于要标记蛋白的用量，CY 染料与蛋白的最佳摩尔比为 10 左右。
例：假如所需标记蛋白为 500 μL 2 mg/mL 的 IgG (MW=150,000),，用 100 μL DMSO 溶解一管 1 mg CY 染料，则所需 CY 体积的详细计算流程如下 (以 CY3-NHS ester 为例) ：
1) mmol (IgG) = mg/mL (IgG) ×mL (IgG) / MW (IgG) =2 mg/mL×0.5 mL / 150,000 mg/mmol= 6.7×10^-6 mmol
2) mmol (CY3-NHS ester) = mmol (IgG) ×10 =6.7×10^-6 mmol×10 = 6.7×10^-5 mmol
3) μL (CY3-NHS ester) = mmol (CY3-NHS ester) ×MW (CY3-NHS ester) / mg/μL (CY3-NHS ester) = 6.7×10^-5 mmol× 917.05 mg/mmol / 0.01 mg/μL

2. 标记反应
(1) 取算好体积的新鲜配制的 10 mg/mL CY 染料缓慢加入到 0.5 mL 蛋白样品溶液中，轻轻摇匀混合，然后短暂离心将样品收集在反应管底部。切忌剧烈混匀，防止蛋白样品变性失活。
(2) 将该反应小管置于避光处，在室温条件下轻轻摇晃孵育 60 分钟，每隔 10–15 分钟，将反应小管轻轻颠倒几次，以充分混合两种反应物，提高标记效率。
3. 蛋白纯化脱盐
以下方案是使用 SepHadex G-25 柱纯化染料蛋白偶联物为例。
(1) 按照生产说明书制备 SepHadex G-25 柱。
(2) 将反应混合物装入 SepHadex G-25 色谱柱顶部。
(3) 当样品运行到顶部树脂表面下方时，立即加入 PBS (pH 7.2-7.4)。
(4) 向所需样品中加入更多的 PBS (pH 7.2-7.4)，完成柱纯化，结合含有所需要的染料-蛋白质缀合物的组分。