操作指南(以下是 SparkJade 的推荐方案。本方案仅提供指导原则,请根据您的具体实验进行修改)
细胞标记 [1]:
适用于正在发生凋亡的 HeLa 细胞和人外周血单个核细胞 (PBMC) (活的 HeLa 和 PBMC 不被 FITC-Dextran 染色)。
1. 43.5°C 孵育 1 小时,37°C 孵育 8 小时,诱导细胞凋亡。
2. 将细胞悬浮在 100 μL 的培养基中,在 Q-prep 管与 10 μL 的 propidium iodide (PI),10 μL 的 FITC-Dextran (MW 10000) 混合,PI 和 FITC-Dextran (MW 10000) 的最终浓度分别为 7.5 μM 和 1.13 μM。
3. 将细胞在室温黑暗条件下培养 25 分钟。
4. 取 3 mL 培养基的标记细胞,500 g 离心 10 分钟。
5. 取离心细胞,加入 1 mL 培养基,用流式细胞术或荧光显微镜分析 (PI: Ex=500 nm,Em=600 nm,FITC-Dextran (MW 10000):Ex=495 nm,Em=525 nm)。
细胞旁渗透性检测 [2]:
1. 在 transwell 室的基础培养基中加入 FITC-Dextran (0.1 mg/mL)。
2. 在 15 分钟后从 transwell 插入器中收集培养基。
3. 测量荧光信号 (Ex=485 nm,Em=538 nm)。
4. 根据荧光强度计算 FITC-Dextran 浓度。
5. 计算渗透率。
肠屏障功能测定 [3]:
1. 小鼠饥饿处理 4 小时。
2. FITC-Dextran MW 10000 灌胃小鼠 (0.6 mg/g)。
3. 在 4 小时内测量荧光强度。