操作指南 (以下是 SparkJade 的推荐方案。本方案仅提供指导原则,请根据您的具体实验进行修改)
1. 制备 Di 染色溶液
1.1 制备 DMF、DMSO 或乙醇储备溶液:储备溶液应在 1-5 mM 的二甲基甲酰胺 (DMF) 、二甲基亚砜 (DMSO) 或乙醇 DMSO 中制备。DMF 比乙醇更适合作为 Di 的溶剂。储备溶液应及时使用。任何未使用的溶液可分装储存在 -20℃,避免反复冻融。
1.2 制备工作溶液:将储备溶液稀释到合适的缓冲液中,如无血清培养基、HBS 或 PBS,以制备 1-5 μM 工作溶液,现配现用。
【注】:应根据经验确定不同实验条件下工作溶液的最终浓度。
2. 悬浮细胞
2.1 悬浮细胞:离心收集细胞,加入 PBS 洗涤两次,每次 5 分钟。细胞密度在 1×106/mL。
2.2 加入 1 mL Di 工作液,室温孵育 5-30 分钟。
2.3 400 g,4℃ 离心 3-4 分钟,弃去上清。
2.4 加入 PBS 洗涤细胞两次,每次 5 分钟。
2.5 用 1 mL 无血清培养基或 PBS 重悬细胞后,使用荧光显微镜或流式细胞仪进行观察。
3. 贴壁细胞
3.1 将贴壁细胞培养于无菌盖玻片上。
3.2 从培养基中移出盖玻片,吸除多余培养基。
3.3 加入 100 μL 染料工作液,轻轻晃动使其完全覆盖细胞,孵育 5-30 分钟。
3.4 吸去染料工作液,用培养基洗 2-3 次,每次 5 分钟,使用荧光显微镜或流式细胞仪进行观察。