操作指南 (以下是 SparkJade 的推荐方案。本方案仅提供指导原则,请根据您的具体实验进行修改) (仅供参考):
1. 将 1 g Poloxamer 407 溶解在 10 mL 蒸馏水中,制成 10 % (w/v) 的原液,或将 2 g Poloxamer 407 溶解在 10 mL DMSO 中,制成 20 % (w/v) 的原液。这些可能需要从 40 到 50°C 加热约 30 分钟。溶液保存在室温下。
2. 将 10 % 或 20 % 的 Poloxamer 407 原液以 1:1000 至 1:5000 稀释到细胞负载缓冲液中,如 Hanks 和 20 mM Hepes 缓冲液 (HHBS),以达到 0.02 至 0.04% 的工作溶液。
3. 然后将 AM 酯的 DMSO 原液稀释到 0.02-0.04% 的工作溶液中,使 AM 酯的最终浓度在 1 μM-10 μM 之间。Poloxamer 407 的最终浓度通常保持在或低于 0.08%。
4. 细胞在所需温度下孵育 10 分钟至 1 小时。一般来说,使用所需的最小数量的 AM 酯来实现足够的荧光信号到噪声水平是可取的。
5. 标记后用 HHBS 或新鲜培养基清洗细胞,然后开始实验。
注意事项:
1. Poloxamer 407 的终浓度通常不宜超过 0.1%,但对于较弱的荧光染料,如 SBFI AM、PBFI AM、quin-2 AM 和 Fura Red AM 等,可能需要较高浓度的 Poloxamer 407。
2. 配制 Poloxamer 407 储存液过程中需要在 40-50℃ 加热约 30 分钟。配制好的溶液须室温保存,不宜冷藏或冷冻如果有结晶析出,如果观察到沉淀,可以通过加热到 37°C 并在使用前涡流溶解沉淀物,不影响使用。