高通量筛选（High- throughput screening，HTS）是指以分子或和细胞水平的实验方法为基础，采用不同密度的微孔板作为实验载体和自动化工具操作实验步骤，通过快速灵敏的检测装置在同一时间内对海量样品进行生物活性测定、采集实验数据和数字化分析处理，并以相应的信息管理软件支持整个系统正常运转的技术体系。

作为发现新的靶标及活性分子的一种重要策略，高通量筛选是药物研发过程中非常重要的环节。通过高通量、自动化的筛选，研究人员可以获得大量的实验信息，高效地实现对活性化合物、抗体、基因等的表征和鉴定，从而更好地推进药物研究的发展。

传统的药物发现模式是在确定药物作用靶点及其功能和/或结构的基础上，采用各种实验手段，通过体内外多种模型对样品进行筛选，评价其生物活性和药理特征。根据活性分子的特点，进行化合物结构的优化改造，经动物毒理和药代动力学分析研究后确定药物先导化合物,进入人体临床试验。

这种方法一般需要消耗大量的样品和实验动物，对技术人员的操作技能有较高要求，难以在短时间内对一定数量的样品开展有效和经济的筛选。随着各类化合物样品库储量的不断增加以及组合化学技术的应用，采用传统手段筛选海量样品不仅不可能而且极大地限制了新药研究之进程。

高通量药物筛选在传统筛选手段的基础上，综合应用多种先进的技术成果和制造工艺，使药物发现的方式方法和理论模式产生了巨大的变化。高通量药物筛选技术以药物与靶分子或靶细胞之间的作用机理为依据进行生物活性分析，通过整合计算机控制、自动化操作、平行多道检测和数据采集处理等各个步骤，达到微量、快速、灵敏、准确的目标，是当代新药发现技术的重大进步，为全球各大医药公司和著名研究机构所广泛使用。

与传统的药物筛选方法相比，高通量筛选技术具有反应体积小，自动化，灵敏快速检测，高度特异性等优点。但是，高通量筛选作为药物筛选的方法，并不是一种万能的手段，特别是在中药研究方面，其局限性也是十分明显的。

首先，高通量筛选所采用的主要是分子、细胞水平的体外实验模型，因此任何模型都不可能充分反映药物的全面药理作用；
其次，用于高通量筛选的模型是有限的和不断发展的，要建立反映机体全部生理机能或药物对整个机体作用的理想模型，也是不现实的。但我们应该相信，随着对高通量筛选研究的不断深入，随着对筛选模型的评价标准、新的药物作用靶点的发现以及筛选模型的新颖性和实用性的统一，高通量筛选技术必将在未来的药物研究中发挥越来越重要的作用。

高通量筛选由五个技术元件组成：
（1）化合物样品库
拥有足够数量和结构各异的化合物样品是实施高通量药物筛选的基本条件之一。化合物样品库是由诸多具有不同属性的有机化合物所组成的，包括人工合成、天然产物和微生物次生代谢物等多种来源。
（2）特异性体外筛选模型
高通量筛选不仅要求微升级的反应体积，而且要求这种反应具有靶点特异性和检测敏感性，由此建立的筛选模型呈现出很高的技术含量。
（3）自动化操作系统
利用计算机通过操作软件控制整个实验过程。操作软件采用实物图像代表实验用具，简洁明了地以图示体现机器的动作。自动化操作系统的工作能力取决于系统的组分，根据需要可配置加样、冲洗、温孵和离心等设备以进行相应的实验步骤。
（4）高灵敏的检测仪器
检测仪器一般包括液闪计数器、化学发光检测器、宽谱带分光光度仪和荧光光度仪等。
（5）数据处理管理系统
数据处理管理系统主要承担着化合物样品及其生物活性信息的收集、存储、分析、处理、整合和演绎的功能，为提供高通量药物筛选服务和药物发现与设计研究提供支撑。

一： 筛选模型的建立

根据实验模型不同，可以将筛选体系分为靶点的筛选 (target-based drug discovery, TDD) 和基于表型的筛选表型筛选 (phenotypic drug discovery, PDD)；

基于靶点的筛选可以有效的筛选到具有生物活性的小分子物质，这种筛选方式定位于特定的靶蛋白，例如，激酶、组蛋白去乙酰化酶、G蛋白偶联受体等。通过此方法筛选得到的小分子活性物质对靶点具有强烈的影响作用。

与传统的基于靶点的筛选方法相比，表型筛选是一种筛选具有高潜力药物靶点的快速有效方法。表型筛选是对全基因组的筛选，覆盖了所有与所筛选表型有关的靶点及信号通路，吸收，分配，代谢，排泄因素都考虑在内。这种筛选非常适合对机制不明的疾病的靶点的筛选。

【注1】：选择或者设计相对最符合筛选目的筛选系统。若研究基础充分，可优先选择靶点的筛选系统。尽可能一次筛选获得多种信号，即每孔产生多个信号(例如细胞毒性以及萤光素酶活性)。同时还要确认多种信号之间是否会有相互干扰的现象，通过调节加样顺序或者移除溶液方式来排除干扰。鉴于任何一种筛选系统都可能存在系统假阳性，建议设立多种筛选系统层层过滤以期获取潜力高的活性分子。

【注2】筛选体系：可以分为分子水平筛选体系或者是细胞水平筛选体系。

【注3】要根据自己的检测信号的不同，选择不同的孔板选择，比如检测 Fluorescence 信号，首选黑色多孔板；检测 Absorbance 信号，一定是全透明多孔板等。

【注4】DMSO 耐受程度：通常无论分子水平还是细胞水平筛选体系都要考虑 DMSO 的耐受情况，尤其是干细胞。

【注5】分子水平筛选系统中反应 buffer 非常重要，选择合适的缓冲液保证蛋白的活性同时可加入 BSA 或者 Tween 20 等去垢剂以去除非特异性吸附，降低系统背景信号。

二： 整版测试

【注1】 每块筛选板都要设置阴、阳性DMSO组对照。

【注2】 对照组设置在 96 孔板column 1 和12；对照组设置在 384 孔板 column 1、2、23 和 24。

【注3】 实验结果中若有明显边缘效应，进行逐行 normalize 实验数据。即该行的筛选数据以该行的阴、阳性对照为参照。

【注4】 根据 Z' 值 和 CV 值来评估和优化体系。

三： 选择筛选化合物库

研究者可以根据自己的研发方向和研究目的选择不同类型的分子库。比如希望扩大已上市或已有药物的新适应症，可以选择 FDA分子库或者药物功能重定位分子库；希望从天然产物中发现新的药物，可以选择天然产物化合物库；计划探究一些代谢疾病的调控机制，可以选择代谢/蛋白酶化合物等。

【注1】化合物库的储存：充分权衡死体积、冻融次数、成本这三个因素，利用工作站分装出合适的子板套数。化合物库优先储存在-80°C，若空间不够则储存在 -30°C 或者 -20°C。储存化合物库的孔板材质应为 PP 聚丙烯材质。

【注2】化合物库的操作：尽量缩短每次化合物库操作的时长，分装加样完毕尽快封好膜，冻存起来。尽量在避光、干燥环境下操作化合物库。

【注3】化合物的稀释：从 DMSO 相到水溶液相的稀释比例尽量不低于 1:100，否则化合物在水溶液中溶解度会有影响。

四： 初筛

以细胞水平筛选体系中检测细胞增殖为例。 细胞增殖的初筛一般选择终点法 (End Point)。常用的试剂有 CCK-8、Alamar Blue, Presto Blue, CellTiter Glo 等。实验初筛建议先采用单一浓度进行筛选。常用的是 10 μM 进行筛选 (如果细胞可以耐受较高的 DMSO 含量，初筛使用浓度也可以增加到 30 μM/50 μM；注意做好 DMSO 溶剂对照!) ，对比抑制率/激活率或者根据化合物筛选的活性数据及数量筛选出阳性化合物。该实验当天完成，待绝大多数细胞贴壁后即可检测信号；悬浮细胞在接种后即可检测。

【注】：初筛使用的化合物浓度越低，筛选出的化合物越少，相对活性越高。

五： 复筛

将初筛获得的阳性化合物设置不同浓度梯度进行复筛。建议设置 6-7 个浓度，稀释范围尽量高于四个数量级，最高浓度设置可以参考 DMSO 耐受测试数据，一般不超过 100 μM，每种浓度至少设置 3 个重复。通过复筛结果，排除假阳性化合物及无浓度依赖关系化合物，选择出最佳活性化合物。

六： 先导化合物验证

由于每种检测方法都存在一定的限制，所以对于初筛或复筛得到的苗头化合物，还需要通过采用与初筛和复筛不同的检测方法做进一步验证分析，以排除假阳性。

筛选模型是指用于检测药物作用的实验方法。由于高通量筛选要求反应总体积小、特异性强和敏感性高，因此对于筛选模型也有较高的技术标准。根据实验模型的不同，高通量筛选方法可以大致分为两类：基于分子水平的筛选和基于细胞水平的筛选。

一：分子水平的药物筛选模型：
分子水平的筛选可以检测酶或受体功能的改变、探针与蛋白质的结合，以及蛋白-配体结合的动力学特征等。该类筛选方法具有系统简单、作用直接、检测快速、操作便捷的特点。分子水平的药物筛选模型，其中包括：分子互作筛选模型，分子活性筛选模型等
（1）分子互作筛选模型
分子互作筛选模型是基于分子互作的原理实现的，即利用分子（小分子与大分子、大分子与大分子）之间结合的高度特异性的原理，筛选能与待研究的大分子结合的阳性化合物，亦或能调节分子间相互作用的化合物，可利用 SPR、BLI 及 FRET 等技术实现。

（2）分子活性筛选模型
  分子活性筛选模型目前主要指酶活性的筛选模型，可利用各种检测手段来研究化合物对酶活性的调控。比如：在酶的特异性底物两端偶联荧光素和荧光猝灭基团，二者间由于距离足够的接近产生 FRET 现象。当底物被对应酶水解后，这种 FRET 现象被打破，而酶被抑制后 FRET 现象不被打破，以此作为酶抑制剂筛选模型的理论基础；另一种情况，利用酶对底物多肽的修饰（磷酸化、乙酰化和泛素化等），加入带猝灭剂或能产生共振的另一种荧光基团标记的抗体，检测 FRET 现象，以此检测酶对底物的修饰活性。

二： 细胞水平的药物筛选模型
细胞水平的筛选则是利用完整的细胞，通过细胞活力检测、基因编辑、报告基因、高内涵成像等技术寻找潜在的药物作用靶点，发掘有潜力的活性分子。细胞水平的筛选方法具有可视化、动态、多参数综合评价等突出优势。例如，报告基因筛选模型是指将易于被检测到的外源基因导入受体细胞，并检测其表达活性的一类特殊用途的基因，可基于该基因表达情况，筛选各种启动子抑制剂；离子通道是一类重要的药物作用靶标，其抑制剂或激动剂筛选是基于特异性探针染料标记的原理实现的，主要是对细胞内特定的离子进行标记，并通过荧光信号判断离子通道开闭情况；检测细胞增殖的 MTT 模型等。

虽然由高通量获得的实验结果较为准确，易于评价，但其检测模型均建立在单个药物作用靶分子的基础上，无法全面反映被筛样品的生物活性特征，如化合物对细胞产生的多种特异效应包括毒性作用。显微荧光标记、数码影像分析以及图像数据处理技术的快速发展，使以高通量方式对细胞的多个生理环节进行检测成为可能，有力地推动了药物筛选技术由高通量筛选向高内涵筛选（High content screening, HCS）发展的革命性转变。

高内涵筛选是指在保持细胞结构和功能完整性的前提下，同时检测被筛样品对细胞形态、生长、分化、迁移、凋亡、代谢途径及信号转导各个环节的影响，在单一实验中获取大量相关信息，确定其生物活性和潜在毒性。从技术层面而言，高内涵筛选是一种应用高分辨率的荧光数码影像系统，在细胞水平上检测多个指标的多元化、功能性筛选技术，旨在获得被筛样品对细胞产生的多维立体和实时快速的生物效应信息。高内涵筛选技术的检测范围包括：靶点激活、细胞凋亡、分裂指数、蛋白转位、细胞活力、细胞迁移、受体内化、细胞毒性、细胞周期和信号转导等。
业界人士认为，高内涵筛选不仅能阐明被筛样品与药靶的相互作用关系，而且可同时了解细胞的其他生物学改变，进而研究其对相关代谢途径的影响，并通过观察细胞形态来预测化合物的毒性。应用高内涵筛选技术能够加速发现具有潜在开发前景的活性化合物，设定深入评价的优先次序，为构效关系研究和结构优化改造提供有力的支持。因此，高内涵筛选代表着创新药物研究技术发展的必然趋势。