一、蛋白质印迹（Western Blot, WB）
又称为免疫印迹（Immunoblot），是利用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）将样品中分子量大小不同的蛋白分开，然后通过电转移的方法将凝胶中的蛋白转移到固相膜上，再利用抗原、抗体的特异性结合反应，特殊的抗体标记技术以及相应的检测方法，进而对目的蛋白进行定性、相对定量检测的技术。
二、Western Blot用途
- 检测目标蛋白有无、大小
- 检测处理后目标蛋白的表达量变化
- 检测目标蛋白在不同的细胞或组织中的表达量差异
三、Western Blot实验流程
四、样本制备
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五、电泳分离
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六、转膜
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七、封闭
封闭对于防止转移的蛋白质、膜和实验中使用的后续试剂之间的非特异性相互作用至关重要。在做Western blot实验中，会用到固相载体(如NC膜，PVDF膜)，在这些固相载体表面有很多洞洞，通过电转，胶上的蛋白被转移到膜上，蛋白以机械填补(堆积)和吸附的方式结合于表面。蛋白塞进了表面的很多洞洞里面，但是蛋白并不是连续的，而有很多空隙，抗体也是蛋白，也会被吸附在空的洞里，这样就会有很多非特异性的信号。
所以Western blot的灵敏度某种程度上受限于封闭做的好不好。
常见封闭液的种类：
1、牛血清白蛋白（BSA）
牛血清白蛋白是从牛血清中提纯之后的一种球蛋白，是除了脱脂奶粉之外，非常常用的封闭剂。通常含有BSA的封闭液的浓度为2-5%（w/v）。但大家也可以根据自己实验的需要来改变浓度，因为价格比较高，所以很多研究⼈员都是用尽可能低而有效的浓度。虽然BSA不是磷蛋白而且是单一蛋白，但是提纯过程中有可能含有IgG或其他血清蛋白等污染物，这些蛋白都可以和哺乳动物抗体产生交叉反应，会增加非特异性背景信号。
2、脱脂奶粉
最便宜而且最好买的封闭剂就属脱脂奶粉了。无论是从化学制品公司还是从超市购买，都可以直接拿来使用。通常封闭液的浓度为 2.5-5% （w/v）。但值得注意的是，脱脂奶粉是许多种蛋白质的混合物，其中含有酪蛋白，是一种磷蛋白。如果你的目标蛋白是磷蛋白的话，千万不要选择脱脂奶粉，否则会有很多背景信号。即使你的目标蛋白不是磷蛋白，因为是蛋白质的混合物，所以也容易产生较高的背景信号。此外，因为自身含有生物素,不能用于生物素标记的抗体系统。
3、商品化封闭液
通常含有提纯过的蛋白，用这个封闭液的好处就是你可以确定里面不含有磷蛋白、免疫球蛋白、白蛋白、生物素等其他封闭液中难以避免的成分。当然，价格也就更贵。每个商品化封闭液都有自己的Protocol，基本照做就没问题。
封闭的条件：
室温或者 37℃缓慢摇荡1～2 h，特殊情况也可 4℃过夜。根据结果情况调整封闭试剂的浓度和类型。比如脱脂奶粉的封闭效果更强，但有时 BSA 比脱脂奶粉更有利于降低非特异性背景，而有些抗体则在脱脂奶粉封闭的情况下才能得到清晰的背景。
总的来说，没有适用于所有体系的封闭液，但是封闭液的选择基于3样事情：抗原、抗体、检测系统。想找到适合⾃⼰⽬标蛋⽩的封闭液，并不简单。除了排出⼀些很明显不合适的，剩下的就需要多花点时间尝试不同种类、不同浓度的封闭液，才能找到最适合的。
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