产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）是一种革兰氏阳性粗大杆菌，菌体大小为0.9-1.3μm×3.0～9.0μm，无鞭毛、没有运动性，可产生芽胞，芽胞呈椭圆形，位于菌体的次极端。该菌在体内增殖过程中会产生芽胞但体外培养过程不易形成芽胞，通常使用无糖培养基或在不利于细菌生长的条件下进行促芽胞生长。当感染机体时，该菌可以形成明显的荚膜，其荚膜形成能力与菌株毒力、侵袭力呈正相关，根据其产生的特异性毒素，产气荚膜梭菌可以被分为7个型别（A、B、C、D、E、F、G），其不同型别会导致不同的疾病发生。
该菌为一类可以产生H2S等气体的厌氧菌，可在0.1%的氧气浓度下生长，当氧气浓度低于5ppm，有充足养分时，可每八分钟进行一次二分裂。该菌的DNA中的G+C分子含量为24～27%，基因组中含有大量营养相关代谢基因，因此能够利用分解多种糖类，如葡萄糖、麦芽糖、乳糖和蔗糖，并在代谢过程中产生大量的酸和气体，因此在牛乳培养基发酵试验中会产生“汹涌发酵”现象，最适生长温度为37-42℃。由于可产生α、θ毒素，因此在血平板上生长时，可以观察到双层溶血环。在疱肉培养基培养时，可见肉渣转变为略带粉色并伴有大量气体。
图一
产气荚膜梭菌毒素分型及宿主
产气荚膜梭菌广泛存在于自然界的水体与土壤中，常通过污染的水源食品感染人类，因其可产生抵御恶劣环境的芽胞使得常规的烹制无法有效杀灭病原菌，并且因其可产生多种侵袭毒素使得极易发生严重食物中毒从而威胁生命，据报道美国每年约有100万人感染产气荚膜梭菌导致剧烈疼痛及腹泻，未及时就医者其病死率高达50%。为预防控制该菌的流行各国相关部门均推出该菌的实验室检测流程，目前中国国内执行的标准为GB 4789.13-2012《食品安全国家标准食品微生物学检验 产气荚膜梭菌检验》和GB 8538-2016《食品安全国家标准饮用天然矿泉水检验方法》这个两款标准。二者所适用范围有所不同，以下检测实验均以GB 4789.13-2012进行方案研讨。
本方法适用于各类食品和食物中毒中产气荚膜梭菌的检验。国标技术流程如图二所示，相较于2003版培养分离阶段区别在于由SPS培养基替换为TSC培养基，其主要原因为TSC营养更为丰富，且TSC与H2S的显色反应更加灵敏，从而提高了产气荚膜梭菌的检出率，进一步降低了假阴性概率。确证阶段采用明胶液化替代卵磷脂分解试验，其原因在于，部分产气荚膜梭菌卵磷脂酶活性较差易产生假阴性。
图二
产气荚膜梭菌GB 4789.13-2012
（1）以无菌操作称取25g（mL）样品放入含有225mL 0.1%蛋白胨水的均质袋中，在拍击式均质器上连续均质1 min～2min作为1:10稀释液，以1:10稀释液按1mL 加 0.1%蛋白胨水9mL制备10-2～10-6的系列稀释液。
（2）吸取各稀释液 1mL 加入无菌平皿内，每个稀释度做两个平行。每个平皿倾注冷却至 50 ℃的TSC，平板凝固后，再加10mL 冷却至50 ℃的TSC琼脂均匀覆盖平板表层。正置于思科捷厌氧系统中并设置为厌氧模式，氧气在60s内降低至5ppm（百万分之五），厌氧完毕后转移至生化培养箱36℃±1 ℃培养20h～24h。
图三
思科捷厌氧系统
（3）典型的产气荚膜梭菌在TSC琼脂平板上为黑色菌落。
（1）在样本稀释阶段相较于PBS和0.9%NaCl的方法采用蛋白胨稀释液可以更好保护菌体减少菌体死亡因而降低假阴性率。
（2）培养阶段国标采用双层琼脂法，其意义在于可提供更佳的厌氧条件，同时捕捉微量的H2S，如若使用思科捷厌氧系统则可使用涂布法或倾倒法，该系统可提供更好的厌氧环境O2≤5ppm并且避免产气包会吸收H2S导致显色异常的情况，简化操作流程。
（1）挑选五个黑色单菌落，分别接种到FTG培养基，36 ℃±1 ℃培养18h～24h。
（2）革兰氏染色镜检。
（3）如果培养液不纯，重复步骤（1）。
（4）取生长旺盛的FTG培养液1mL接种于含铁牛乳培养基，在46℃±0.5℃水浴中培养2h后，每小时观察一次有无“暴烈发酵”现象，5h内不发酵者为阴性。
（5）取 FTG 培养液穿刺接种缓冲动力-硝酸盐培养基，于36℃±1℃培养24h。在透射光下检查细菌沿穿刺线的生长情况，判定有无动力。缓冲动力-硝酸盐培养基滴加0.5mL对氨基苯磺酸溶液和0.2mLα-萘酚乙酸溶液以检查亚硝酸盐的存在。
（6）取FTG培养液穿刺接种乳糖-明胶培养基，于36℃±1℃培养24h，观察结果。
图四
产气荚膜梭菌使用厌氧系统进行分离培养
在TSC培养基呈现黑色菌落
分离培养阶段如采用倾倒法、双层琼脂法会存在有杂菌悬浮在目标菌落之上在挑单菌落时可能误挑杂菌导致纯化效果不佳，因此建议使用厌氧系统使用涂布法或划线法更佳利于单菌落的纯化分离。
在革兰氏染色镜检时不易镜检到有芽胞的产气荚膜梭菌，其芽胞是在压力环境下才会产生，难以在TSC、FTG中检出。含铁牛乳培养基建议使用全脂乳，灭菌温度118℃，12min灭菌时避开加热棒，灭菌结束进行水浴降温，此方法可避免蛋白变性析出。在穿刺实验、明胶液化实验中应注意厌氧气氛的保持，并注意不要产生过多的冷凝水，避免影响实验观察。
