✦引物的长度一般在15-30 bp，常用的是18-27 bp。

✦引物过长（如超过38 bp）会导致其延伸温度大于74℃，不利于聚合酶进行反应，从而会增加PCR反应的复杂性。

✦引物过短则会导致引物特异性太差，引起非特异性扩增。

✦引物GC含量一般在40%~60%。

✦引物的GC含量过高时，退火温度也会相应增加，较高的退火温度也可能影响到引物与模板之间的正常结合；另外，高GC含量可能导致引物更容易形成二级结构如发卡结构或内部稳定配对，这会干扰引物与目标模板的有效结合。

✦引物GC含量过低会引发AT含量的相应增高，‌从而与模板的结合能力降低，不利于PCR的特异性反应。

✦上下游引物的GC含量不能相差太大。

✦Tm值就是DNA熔解温度，指DNA双螺旋结构解链至一半时的温度。

✦Tm值一般在58-70℃，Tm值越高，特异性越高，但杂交率越低。

✦上下游引物的Tm值应尽可能接近，最好不超过4℃。

✦Tm值计算经验公式，Tm=4（G+C）+2（A+T）。

✦引物3'端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异。当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低。G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以在设计时最好选择T作为引物的3'末端。

✦引物序列不要有嘌呤或嘧啶的聚集，尤其是3'端，若出现3个以上的连续碱基，如GGG、CCC会使错配几率增加。

✦引物的延伸是从3'端开始的，不能进行任何修饰。

✦引物的5′端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。

✦引物5′端修饰包括：加酶切位点，标记生物素、荧光、地高辛等，引入蛋白质结合DNA 序列，引入点突变、插入突变、缺失突变序列，引入启动子序列等。

✦发卡结构指的是一条引物自身碱基之间发生配对，因此引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构。

✦二聚体指的是同一对引物的两条链之间发生碱基互补配对，尤其应避免3′端的互补重叠以防止引物二聚体的形成。

✦∆G 值是指DNA双链形成所需的自由能，它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性，∆G 值越大，则双链越稳定。

✦应当选用5′端和中间∆G值相对较高，而3′端∆G值较低（绝对值不超过9）的引物。

✦引物3′端的∆G值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。

✦引物设计完成以后，应对其进行BLAST检测。如果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验了。

实验中的PCR模板“千奇百怪”，引物设计起来也是“状况百出”。比如，想要通过克隆得到固定序列的PCR产物，那么引物设计的选择自由度会相对较低，导致找不到各种指标都十分合适的引物，在这种情况下只能退而求其次，尽量去满足条件咯。