荧光染料法：SYBR Green I染料法

使用能够与双链DNA结合的荧光染料，如SYBR Green I染料法。当染料与双链DNA结合时，其荧光强度会增强，可以通过检测荧光信号强度的变化来监测PCR产物的累积。

变性

退火

延伸

   ↑↑↑图1  

优点：

通用性强：检测不同基因只需更换引物。成本低：无需合成昂贵探针。

缺点：

可能会产生假阳性信号（如图二）。因为SYBR Green I染料可与任何的双链DNA发生结合，所以也会与非特异性的双链DNA序列发生结合。因此，需通过熔解曲线进行引物特异性分析。

↑↑↑图二

那要如何解决呢？别急星博士来帮你！

1、减少引物添加量或者重新设计引物，增强引物特异性

2、增加样本投入量

3、提高退火温度

4、在超净台中，换用移液器分别加入引物避免交叉污染

荧光探针法：TaqMan探针

使用特异性结合目标基因片段的荧光探针。探针通常包含一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。当探针完整时，淬灭荧光基团抑制报告荧光基团的发光。PCR扩增时,Taq酶的5’- 3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。

热变性

引物和探针与模板退火

延伸反应

↑↑↑图三

优点：

检测特异性强；灵敏度高；适合进行多重qPCR检测；PCR后续无需处理，节省时间和原料成本。

缺点：

需要根据不同的序列，合成不同的探针；探针的水解依赖Taq酶外切酶的活性，定量时容易受试剂和酶性能影响；淬灭难以彻底，本底较高；检测结果很难判断实际的扩增特性。